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バイオシミラーの開発では、その薬剤自体の、先行バイオ医薬品との類似性の高さを示すために、広範な品質特性解析を実施します。
リツキシマブBS「ファイザー」は、原薬および製剤について、下表に示す評価項目により、先行バイオ医薬品との品質特性における同等性/同質性を評価しました。
実施された品質特性解析のうち、主要なデータをご紹介します。
| 物理化学的性質 | |||
| 糖鎖プロファイル | |||
| 生物活性 | |||
バイオシミラーの開発では、その薬剤自体の先行バイオ医薬品との類似性の高さを示すために、広範な品質特性解析を実施します。
ベバシズマブBS「ファイザー」は、下表に示す評価項目により、先行バイオ医薬品との品質特性における同等性/同質性を評価しました。
実施された品質特性解析のうち、主要なデータをご紹介します。
| 物理化学的性質 | ||
| 糖鎖プロファイル | ||
| 生物活性 | ||
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| 物理化学的性質 | |||
| 糖鎖プロファイル | |||
| 生物活性 | |||
原理が異なる複数の試験方法を適用し、本剤のアミノ酸配列が先行バイオ医薬品（EU）#と同一であること、また一次構造および翻訳後修飾が先行バイオ医薬品（EU）#と類似していることが示されました。
● 一次構造および翻訳後修飾の解析に用いた方法および結果の概要
本剤と先行バイオ医薬品（EU）#のペプチドマップのプロファイル（ピークの溶出位置、ピーク形状および相対ピーク強度）は一致しました。また、差異が認められたピークのすべては、酵素消化のばらつきによるものでした。それぞれのピークについて認められた質量は、リツキシマブから予想されるトリプシンペプチドマップと一致しました。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のペプチドマップ
方法：LC/MS-ペプチドマッピング法により、本剤および先行バイオ医薬品（EU）#の一次構造および翻訳後修飾を詳細に分析した。還元アルキル化試料のトリプシン消化物を逆相高速液体クロマトグラフィー（検出波長214nm）でペプチドマップ分析した。主要なピークおよび少量のピークをオンラインエレクトロスプレーイオン化質量分析法にて同定した。
原理が異なる複数の試験方法を適用し、ジスルフィド結合の存在と架橋位置およびジスルフィド結合の状態について、本剤と先行バイオ医薬品（EU）#との類似性が示されました。
● ジスルフィド結合の解析に用いた方法および結果の概要
原理が異なる複数の方法で分析して得られた総合的な試験結果より、高次構造について本剤と先行バイオ医薬品（EU）#との類似性が示されました。
● 高次構造の解析に用いた方法および結果の概要
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#で波長約217nmに負のピークが、約202nmに正のピークがみられ、試料の二次構造は、主にIgG1抗体にみられるβ-シート構造を有することが示されました。波長195～250nmの範囲でスペクトルがよく一致していたことから、二次構造について本剤および先行バイオ医薬品（EU）#との類似性が示されました。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のFar-UV CDスペクトル
方法：CDスペクトルは、試料のタンパク質構造の不斉性に由来する左右円偏光の吸収の差を測定する。CD分光計を用いて、
遠紫外領域の円偏光二色性（CD）スペクトルを測定し、タンパク質の二次構造を分析した。
本剤と先行バイオ医薬品（EU）#で認められた緩やかな正のバンド、数箇所の負の交互のピークおよびトラフは、折り畳まれたタンパク質内の複数のトリプトファン残基、チロシン残基およびジスルフィド結合が組み合わさっている特徴を示しており、三次構造の指標となりえます。250～350nmの範囲の全波長においてスペクトルはよく一致していたことから、三次構造について本剤および先行バイオ医薬品（EU）#との類似性が示されました。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のNear-UV CDスペクトル
方法：波長範囲250～350nmのNear-UV CDスペクトルでは、主に芳香族アミノ酸（トリプトファンおよびチロシン）、ジスルフィド結合による光の吸収が認められる。吸収の強度は周囲のアミノ酸側鎖との相互作用によって変化する性質を利用して、Near-UVシグナルにより、タンパク質の三次構造を分析した。
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#において2つの顕著な熱転移温度（Tm1およびTm2）が認められました。また、DSC曲線は25～95℃の温度範囲全域で互いによく一致し、高次構造について本剤および先行バイオ医薬品（EU）#との類似性が示されました。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のDSC曲線（示差走査熱量測定法）
方法：示差走査熱量測定法（DSC）を用いて高次構造の熱安定性を解析した。温度を変動させたときのタンパク質溶液の比熱容量（Cp）の変化を測定し、折り畳み構造がほどける転移中点温度（Tm）および転移に要する熱量を基に、高次構造を評価した。
原理が異なる複数の方法で分析して得られた総合的な試験結果より、電荷不均一性を評価しました。電荷分子種の種類および酸性分子種含量については本剤と先行バイオ医薬品（EU）#との類似性が示されたが、塩基性分子種含量については差異が認められました。
塩基性分子種含量にみられた差異は、重鎖のC末端にリシン残基を有する分子種の割合が本剤で高かったことによるものでした。この重鎖C末端の不均一性による塩基性分子種含量の差異はモノクローナル抗体でよくみられる特徴であり、C末端リシンを含む分子種は安全性および免疫原性に影響せず1-3）、C末端リシンは生体内で速やかに切断され2)、標的抗原との結合および体内動態に影響を及ぼさない4）ことが報告されています。
1） Antes, B. et al.：J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 852（1-2）：250, 2007［L20180913001］
2） Cai, B. et al.：Biotechnol Bioeng 108（2）：404, 2011［L20180913002］
3）Johnson, K.A. et al.: Anal Biochem. 360（1）：75, 2007［L20180913003］
4） Schiestl, M. et al.：Nat Biotechnol 29（4）：310, 2011［L20180510008］
● 電荷不均一性の解析に用いた方法および結果の概要
原理が異なる複数の方法で分析して得られた総合的な試験結果より、純度について、本剤と先行バイオ医薬品（EU）#との類似性が示されました。
● 純度の解析に用いた方法および結果の概要
原理が異なる複数の方法で分析して得られた総合的な試験結果より、N-結合型糖鎖については本剤と先行バイオ医薬品（EU）#との類似性が示されました。
● N-結合型糖鎖の解析に用いた方法および結果の概要
本剤と先行バイオ医薬品（EU）#のN-結合型糖鎖プロファイルを評価した結果、主要な糖鎖種［G0F、G1F（a＋b）］において類似していることが示されました。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#の代表的なN-結合型糖鎖マップ
方法：酵素的な切断後に、蛍光標識されたN-結合型糖鎖につき蛍光光度計を用いた親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）で分析し、LC/MSによってN-結合型糖鎖の量を評価した。シアル酸においても同様に評価した。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#の各ロットの末端ガラクトシル化糖鎖および総アフコシル化糖鎖
方法：酵素的な切断後に、蛍光標識されたN-結合型糖鎖を親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）で分析した。
● Fab領域の生物活性の解析に用いた方法および結果の概要
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#と標準物質を比較したCD20結合の濃度反応曲線は下図の通りで、いずれも濃度依存的なCD20結合活性が示されました。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のCD20結合活性（濃度反応曲線）
標準物質に対する本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のCD20結合活性のEC50値の相対値（％EC50値）を評価した結果、相対値の分布［本剤群85～110％、先行バイオ医薬品（EU）#群90～102％］は重なっており、平均値は本剤99％、先行バイオ医薬品（EU）#97％でした。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のCD20結合活性（相対活性）
方法：CD20を細胞表面上に発現するRamos細胞（ヒトB細胞リンパ腫細胞株）を用い、本剤、先行バイオ医薬品（EU）#、標準物質をそれぞれ含む培養液で培養後、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識抗ヒトIgG Fc抗体を加え、フローサイトメーターでFITC標識された細胞の蛍光強度を測定した。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のアポトーシス誘導活性（濃度反応曲線）
方法：CD20を細胞表面上に発現するRamos細胞（ヒトB細胞リンパ腫細胞株）を用い、本剤、先行バイオ医薬品（EU）#および抗ヒトFc抗体を加えた後、Caspase Glo3/7 reagentを加え、アポトーシスを示す発光シグナルをプレートリーダーで測定した。
本剤、先行バイオ医薬品（EU）#および標準物質のアポトーシス誘導活性を測定しました。標準物質のアポトーシス誘導活性に対する本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のEC50値の相対値（％EC50値）を評価した結果、相対値の分布［本剤群86～118％、先行バイオ医薬品（EU）#群84～112％］は重なっており、平均値は本剤101％、先行バイオ医薬品（EU）#102％でした。
● 本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のアポトーシス誘導活性（相対活性）
方法：CD20を細胞表面上に発現するRamos細胞（ヒトB細胞リンパ腫細胞株）を用い、本剤、先行バイオ医薬品（EU）#および抗ヒトFc抗体を加えた後、Caspase Glo3/7 reagentを加え、アポトーシスを示す発光シグナルをプレートリーダーで測定した。
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#と標準物質を比較したCDC活性の濃度反応曲線は下図の通りで、いずれも濃度依存的なCDC活性が示されました。
方法：CD20を細胞表面上に発現するRamos細胞（ヒトB細胞リンパ腫細胞株）を用い、本剤がRamos細胞上のCD20と結合し、補体依存性のRamos細胞溶解を引き起こすCDC活性を測定した。CDC活性は、標準物質と試料の用量反応曲線を比較し、標準物質に対する試料の相対力価（％RP）とした。
標準物質に対する本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のCDC活性の相対値（%）を評価した結果、相対値の分布[本剤群78~114%、先行バイオ医薬品（EU）#群89~135%]は重なっており、平均値は本剤98％、先行バイオ医薬品（EU）#104%でした。
方法：CD20を細胞表面上に発現するRamos細胞（ヒトB細胞リンパ腫細胞株）を用い、本剤がRamos細胞上のCD20と結合し、補体依存性のRamos細胞溶解を引き起こすCDC活性を測定した。CDC活性は、標準物質と試料の用量反応曲線を比較し、標準物質に対する試料の相対力価（％RP）とした。
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#は、いずれも濃度依存的なC1q結合性を示し、濃度反応曲線は下図の通りでした。
方法：免疫測定法により、本剤、先行バイオ医薬品（EU）#および標準物質のC1qに対する結合活性を測定した。
標準物質に対する本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のヒト補体タンパクC1ｑに対する結合活性の相対値（％）を評価した結果、相対値の分布［本剤群88～111％、先行バイオ医薬品（EU）#群86～109％］は重なっており、平均値は本剤101％、先行バイオ医薬品（EU）#100％でした。
方法：免疫測定法により、本剤、先行バイオ医薬品（EU）#および標準物質のC1qに対する結合活性を測定した。
1. FcγRⅢa 158V/Vまたは158V/F発現初代培養NK細胞を用いたADCC活性試験
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#と標準物質を比較したADCC活性の濃度反応曲線は下図の通りで、いずれも濃度依存的なADCC活性が示されました。
方法：エフェクター細胞にFcγRⅢa 158V/Vまたは158V/Fを発現する凍結ヒトNK細胞、標的細胞にRamos細胞を用いて、傷害細胞から放出されるアデニル酸キナーゼに由来する発光シグナルをルミノメーターで測定した。標準物質と試料の濃度反応曲線を比較し、標準物質に対する試料の相対EC50（%EC50）値を算出して、ADCC活性を評価した。
標準物質に対する本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のADCC活性のEC50値の相対値（％EC50値）を評価した結果、相対値の分布［本剤群79～108％、先行バイオ医薬品（EU）#群64～106％］は重なっており、平均値は本剤96％、先行バイオ医薬品(EU)#90％でした。
方法：エフェクター細胞にFcγRⅢa 158V/Vまたは158V/Fを発現する凍結ヒトNK細胞、標的細胞にRamos細胞を用いて、傷害細胞から放出されるアデニル酸キナーゼに由来する発光シグナルをルミノメーターで測定した。標準物質と試料の濃度反応曲線を比較し、標準物質に対する試料の相対EC50（%EC50）値を算出して、ADCC活性を評価した。
2. FcγRⅢa 158F/F発現初代培養NK細胞を用いたADCC活性試験
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#と標準物質を比較したADCC活性の濃度反応曲線は下図の通りで、いずれも濃度依存的なADCC活性が示されました。
方法：エフェクター細胞にFcγRⅢa158F/Fを発現する凍結ヒトNK細胞、標的細胞にRamos細胞を用いて、傷害細胞から放出されるアデニル酸キナーゼに由来する発光シグナルをルミノメーターで測定した。標準物質と試料の濃度反応曲線を比較し、標準物質に対する試料の相対EC50（%EC50）値を算出して、ADCC活性を評価した。
標準物質に対する本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のADCC活性のEC50値の相対値（％EC50値）を評価した結果、相対値の分布は、本剤群62～133％、先行バイオ医薬品（EU）#群29～89％、平均値は本剤91％、先行バイオ医薬品（EU）#54％でした。いくつかのロットでは、先行バイオ医薬品（EU）#のADCC活性を超える値を示しました。
方法：エフェクター細胞にFcγRⅢa158F/Fを発現する凍結ヒトNK細胞、標的細胞にRamos細胞を用いて、傷害細胞から放出されるアデニル酸キナーゼに由来する発光シグナルをルミノメーターで測定した。標準物質と試料の濃度反応曲線を比較し、標準物質に対する試料の相対EC50（%EC50）値を算出して、ADCC活性を評価した。
3. FcγRⅢa 158V/F発現PBMCを用いたADCC活性試験
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#と標準物質を比較したADCC活性の濃度反応曲線は下図の通りで、いずれも濃度依存的なADCC活性が示されました。
方法：エフェクター細胞に健康成人から採取したFcγRⅢa 158V/F 発現末梢血単核細胞（PBMC）、標的細胞にRaji 細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）を用いて、傷害細胞から放出されるアデニル酸キナーゼに由来する発光シグナルをルミノメーターで測定した。標準物質と試料の濃度反応曲線を比較し、標準物質に対する試料の相対EC50（%EC50）値を算出して、ADCC活性を評価した。
標準物質に対する本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のADCC活性のEC50値の相対値（％EC50値）を評価した結果、相対値の分布は、本剤群85～112％、先行バイオ医薬品（EU）#群68～113％、平均値は本剤95％、先行バイオ医薬品（EU）#85％でした。
方法：エフェクター細胞に健康成人から採取したFcγRⅢa 158V/F 発現末梢血単核細胞（PBMC）、標的細胞にRaji 細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）を用いて、傷害細胞から放出されるアデニル酸キナーゼに由来する発光シグナルをルミノメーターで測定した。標準物質と試料の濃度反応曲線を比較し、標準物質に対する試料の相対EC50（%EC50）値を算出して、ADCC活性を評価した。
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のFcγRⅢa158V（158番目のアミノ酸がバリンのホモ接合型）およびFcγRⅢa158F（158番目のアミノ酸がフェニルアラニンのホモ接合型）に対する結合親和性（KD）を評価しました。FcγRⅢa158Vについて、本剤の結合親和性の相対値（％KD）は先行バイオ医薬品（EU）#の範囲内であり、類似性が示されました。FcγRⅢa158Fに対するKDはFcγRⅢa158Vに比べて低いため、％KDのばらつきが認められました。FcγRⅢa158Fに対する結合について示された本剤と先行バイオ医薬品（EU）#の％KD値の差異は、ADCC活性に影響を及ぼしませんでした。
方法：SPR法により、本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のFcγRⅢa158VおよびFcγRⅢa158Fに対する結合親和性（kD）を評価した。
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のFcγRⅡa131H（131番目のアミノ酸がヒスチジン）およびFcγRⅡa131R（同アルギニン）に対する結合親和性を評価した結果、本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のFcγRⅡa131H（KD＞1000nmol/L）および131R（KD＞2500nmol/L）に対する結合親和性は低いことが示されました。FcγRⅡa131Rに対するKD値は求めることができませんでした。FcγRⅡa131Hに対する本剤および先行バイオ医薬品（EU）の％KDは下図の通りでした。
方法：SPR法により、本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のFcγRⅡa131HおよびFcγRⅡa131Rに対する結合親和性を評価した。
本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のFcRnに対する結合親和性を評価した結果、SPRセンサーグラムは類似していました。なお、ヒトでの薬物動態における同等性/同質性を評価したB3281001試験に用いた本剤のロット（Y07950）は、FcRnに対する結合親和性の％KD値が104％と先行バイオ医薬品（EU）#に比べて高値でしたが、標準製剤に対する本剤のCmax、AUC2wk、AUClastおよびAUCinfの幾何平均値の比の90％CIはすべて事前に既定した許容範囲（80～125％）に含まれたことから、本剤と先行バイオ医薬品（EU）#の薬物動態における同等性/同質性が示されました。
解離定数（KD）の相対値（％KD＊）は、それぞれ82～114％（n=11）、84～98％（n=11）でした。
方法：SPR法により、本剤および先行バイオ医薬品（EU）#のFcRnに対する結合親和性を評価した。FcRnから得られた値は
SPRの検出範囲外であることが確認されたことから、FcRnに対する本剤および先行バイオ医薬品（EU）#の結合は定常状態解析を用いて評価した。
＊％KD：標準物質で算出された解離定数（KD）に対する試料のKDの相対値
Copyright (c) 2023 Pfizer Japan Inc. All rights reserved.
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